Western轉(zhuǎn)印的優(yōu)化

從SDS凝膠中進(jìn)行Western蛋白轉(zhuǎn)印的優(yōu)化需要對(duì)一系列參數(shù)進(jìn)行考慮。目的是轉(zhuǎn)印所有凝膠上的蛋白并將其定量地轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。進(jìn)行轉(zhuǎn)印需要一定程度的優(yōu)化，尤其是對(duì)于大分子量和小分子量蛋白。

轉(zhuǎn)印后，凝膠上應(yīng)不殘留或殘留很少的蛋白。可以在轉(zhuǎn)印后進(jìn)行染色進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)移出凝膠的蛋白應(yīng)該僅在接觸凝膠的膜的一面可見(jiàn)。如果有懷疑，在轉(zhuǎn)印時(shí)使用第二個(gè)"支持膜"，你可以在轉(zhuǎn)膜后染色，以檢查是否有穿膜的跡象。如果發(fā)現(xiàn)蛋白殘留在凝膠上而且膜的結(jié)合性很差，可以考慮下列因素：

凝膠濃度

丙烯酰胺濃度越低，蛋白越容易轉(zhuǎn)移下來(lái)。選擇可以分離蛋白的濃度zui低的凝膠。梯度膠適用于轉(zhuǎn)印一系列不同大小的蛋白，因?yàn)槟z的孔與不同大小的蛋白匹配良好。

凝膠厚度

蛋白比較易于從薄膠上轉(zhuǎn)移下來(lái)，所以上樣體積允許，使用1.0mm厚的膠取代1.5mm的膠。

電場(chǎng)（電壓×時(shí)間）

如果電壓過(guò)低而且轉(zhuǎn)印時(shí)間過(guò)短，部分蛋白會(huì)殘留在凝膠上。如果電壓過(guò)高，小蛋白會(huì)在結(jié)合到膜上前透膜而出。如果按建議的條件轉(zhuǎn)印后有蛋白殘留在膠上，增加電壓可能會(huì)有幫助，但不要超過(guò)5V。但注意，一旦SDS從蛋白剝離，增加轉(zhuǎn)印時(shí)間或提高電壓就無(wú)效果。一旦結(jié)合，即使延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間，大部分蛋白也會(huì)保持在膜上。

SDS vs 酒精

在多數(shù)轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)步驟中都使用SDS和酒精。但兩者對(duì)于成功的轉(zhuǎn)印有相反的作用，需要根據(jù)欲轉(zhuǎn)印蛋白的性質(zhì)加以優(yōu)化。

SDS對(duì)于蛋白的遷移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白從凝膠上的轉(zhuǎn)移。但由于膜結(jié)合需要疏水相互作用，SDS過(guò)多會(huì)抑制結(jié)合，尤其對(duì)于NC膜。如果從蛋白上剝離太多SDS，將無(wú)法將蛋白轉(zhuǎn)移出膜。作為一個(gè)一般性的規(guī)則，如果膜的結(jié)合力有效，但蛋白仍舊殘留在凝膠上，在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入 0.01％會(huì)促進(jìn)*轉(zhuǎn)印。建議的步驟在轉(zhuǎn)印緩沖液中不含有SDS，但凝膠在電泳后不需要浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液中；凝膠中殘留的SDS對(duì)于有效的轉(zhuǎn)印已經(jīng)足夠。但另一方面，酒精通過(guò)在蛋白上剝離SDS促進(jìn)蛋白和膜的疏水接合。一般在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入20％的甲醇會(huì)增加NC膜的接合能力。

膜的類型

結(jié)合到NC膜（WHATMAN NC膜30cm*3m/0.22um和WHATMAN NC膜30cm*3m/0.45um）上主要通過(guò)疏水鍵。NC膜對(duì)于常規(guī)使用非常好。對(duì)于小的多肽，建議使用小口徑的膜。

PVDF膜（Millipore PVDF膜26.5cm*375cm/0.22um和Millipore PVDF膜26.5cm*375cm/0.45um）比NC膜更疏水，在轉(zhuǎn)印過(guò)程中結(jié)合蛋白更緊密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF一般比NC膜需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件。其適用于蛋白測(cè)序。

尼龍膜（Amersham帶正電荷尼龍膜RPN303B/30cm*3m，0.45um）通過(guò)疏水和靜電相互作用結(jié)合。其SDS耐受度甚至高于PVDF，但也需要更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆忾]條件。主要建議用于Northern和Southern。

做一塊凝膠的轉(zhuǎn)印

1. 在電泳后，將切膠刀的斜邊楔入膠盒兩塊板之間的縫隙中，撬開(kāi)每邊的三個(gè)粘合點(diǎn)。膠盒的凹口（加樣孔）面應(yīng)面向上。在刀柄上來(lái)回推動(dòng)以分離膠板。在膠盒的各邊緣重復(fù)直至膠板*分離。當(dāng)將切膠刀插入到兩塊膠板之間時(shí)必需小心，以免對(duì)凝膠壓力過(guò)大。
2. 當(dāng)打開(kāi)膠盒時(shí)，凝膠會(huì)粘附在膠盒的一邊。小心移除無(wú)凝膠的膠板，使凝膠留存在另一塊膠板上。用切膠刀切除加樣孔。
3. 將一片預(yù)先浸泡過(guò)的濾紙放在凝膠頂部，剛好在凝膠底部的"底腳"的上部（不覆蓋凝膠的底腳）。使用轉(zhuǎn)印緩沖液持續(xù)飽和濾紙，確保趕走了進(jìn)入的氣泡?？梢允褂貌Ａб埔汗茏鳛闈L筒，輕輕在表面滾動(dòng)，從而很容易做到這點(diǎn)。
4. 將膠盒翻轉(zhuǎn)，使凝膠和濾紙面向下放置在戴手套的手掌上或者放有一片Parafilm?膜的干凈平面上。使用下面的一種方法將凝膠從膠板上分離：
a） 如果凝膠在較長(zhǎng)（有狹縫）的膠板上，用切膠刀通過(guò)膠盒上的狹縫輕推底部，凝膠將很容易從膠板分離。
b） 如果凝膠在較短（有凹口）的膠板上，使用切膠刀小心松凝膠的底部，使凝膠從膠板滑離。
5. 放置到平面上后，使用切膠刀切掉凝膠的"底腳"。
6. 使用轉(zhuǎn)印緩沖液潤(rùn)濕凝膠，將預(yù)先浸泡過(guò)的轉(zhuǎn)印膜放在凝膠上。確保趕凈氣泡。
7. 將預(yù)先浸泡過(guò)的陽(yáng)極側(cè)的濾紙放置在凝膠上，確保除去進(jìn)入的氣泡。
8. 將預(yù)先浸泡過(guò)的轉(zhuǎn)印墊放入轉(zhuǎn)印模塊的陰極核心。陰極核心是兩塊核心中較深的一邊，其電極板為暗灰色。小心取出凝膠和膜的組裝體，按同樣順序放在轉(zhuǎn)印墊上，使凝膠距離陰極zui近（圖2）。
9. 加入足夠的預(yù)先浸泡過(guò)的轉(zhuǎn)印墊，使其比陰極核心的邊緣高出0.5cm。將陽(yáng)極核心放在轉(zhuǎn)印墊的上面。凝膠/膜組裝體應(yīng)可以穩(wěn)固在轉(zhuǎn)印模塊的兩半部分之間，以確保所有組件*接觸。因?yàn)檗D(zhuǎn)印墊使用多次后會(huì)失去彈性，所以可能需要多一塊轉(zhuǎn)印墊以確保轉(zhuǎn)印模塊的兩邊*組合。當(dāng)轉(zhuǎn)印墊脫色并開(kāi)始失去彈性時(shí)應(yīng)進(jìn)行更換。
10. 將轉(zhuǎn)印模塊緊緊按在一起，沿滑軌放入電泳槽中。轉(zhuǎn)印模塊只能以一種方式進(jìn)入，所以可以在轉(zhuǎn)印模塊的左上角看到陽(yáng)極標(biāo)志。如果放置正確，轉(zhuǎn)印模塊右手邊倒置的黃金柱電極正好插入電泳槽右上方黃金柱電極近鄰的孔中。
11. a） 對(duì)于Xcell SureLock?:放入張力楔（tension wedge），其垂直面頂住轉(zhuǎn)印模塊， 將凸柄前壓，鎖定電泳槽。
b） 對(duì)于Xcell Ⅱ? Mini-Cell：放置前楔（無(wú)螺孔），其垂直面頂住轉(zhuǎn)印模塊，將后楔滑入，向后推緊。如果放置正確，后楔將不會(huì)和電泳槽上沿平齊。在后楔和電泳槽之間會(huì)有一個(gè)狹縫。
12. 在轉(zhuǎn)印模塊中倒入轉(zhuǎn)印緩沖液直至凝膠/膜復(fù)合層被轉(zhuǎn)印緩沖液覆蓋。不要將液面至頂，這只會(huì)增加導(dǎo)電性和熱量。
13. 通過(guò)電泳槽前端和轉(zhuǎn)印模塊前端的縫隙在外槽中加入650ml去離子水。水面距離電泳槽上沿大概2cm。這是用于運(yùn)行過(guò)程中的散熱。
14. 在上面放上蓋子
15. 在電源關(guān)閉情況下，將紅色和黑色導(dǎo)線插入電源。

做兩塊凝膠的轉(zhuǎn)印

1. 重復(fù)步驟1-6 兩次，制作兩個(gè)凝膠-膜組裝體。
2. 將兩個(gè)預(yù)浸泡過(guò)的轉(zhuǎn)印墊放在轉(zhuǎn)印模塊的陰極外殼上。將*個(gè)凝膠-膜組裝體按正確的方向放在轉(zhuǎn)印墊上，使凝膠離陰極板zui近。
3. 將另一塊預(yù)浸泡過(guò)的轉(zhuǎn)印墊放在*塊膜復(fù)合體上。
4. 將第二個(gè)凝膠-膜組裝體按正確的方向放在轉(zhuǎn)印墊上，使凝膠離陰極板zui近。
5. 進(jìn)行"轉(zhuǎn)印一塊凝膠"中的8-13步。